微生物多样性扩增子测序与功能分析介绍

一、技术介绍

微生物多样性扩增子测序是一种利用高通量测序技术对16S、18S、ITS等微生物特征序列进行PCR扩增并测序分析的研究方法，其中16SrDNA（即16SrRNAgene）应用较多，此方法不需要对微生物进行分离纯化培养，基于提取的总DNA即可开展丰富的微生物群落研究，在医学、工业、食品、环境科学等各领域都有十分广泛的应用。

二、实验流程

从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增16SrDNA的V3+V4区。引物序列为:F:CCTACGGGNGGCWGCAG;R:GGACTACHVGGGTATCTAAT，将纯化后的扩增产物连接测序接头，构建测序文库，Illumina上机测序。

三、信息分析流程

微生物多样性研究主要分为物种组成分析、α多样性分析、β多样性分析、指示物种分析和功能分析，见下图。

16SrDNA测序得原始数据后，提供两种分析策略，基于Usearch软件和基于DADA2软件的分析。Usearch软件先对低质量Reads进行过滤，然后将双端Reads拼接为Tag，对Tag进行低质量过滤，得到的数据称为CleanTag，基于CleanTag，使用Usearch软件进行聚类，去除聚类过程中检测到的嵌合体Tag后获得可操作分类单元（OperationalTaxonomicUnits,OTU）丰度和OTU代表序列用于多样性分析。DADA2软件则是先使用DADA2对Reads进行过滤、校正，并输出非冗余的Reads和对应的丰度信息，然后将Reads拼接为Tag，再去除嵌合体Tag后获得用于后续分析的Tag序列和丰度，即ASV（ampliconsequencevariants）序列和ASV丰度信息。

基于测序所得OTU或ASV的序列、丰度数据，便可进行物种注释、物种组成分析、α多样性分析、β多样性分析、指示物种分析和功能分析等。若存在有效分组，则进行组间差异比较和统计检验。最后，结合其他因素（例如环境因子），进行特定的例如CCA等高级分析，以解答微生物与环境之间的关系。

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1数据处理

测序得到原始数据后，由于PCR错误、测序错误等会产生大量的低质量数据或者无生物学意义数据（例如嵌合体），为保证后续分析具有统计可靠性和生物学有效性，我们在Reads利用、Tag拼接、OTU聚类等多个数据处理过程进行严格的质控。

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2OTU/ASV统计

OTU：将Tag序列按相似度聚类，分成不同的序列集合（cluster），一个cluster即为1个OTU。进行聚类操作既可以提高运算效率，还可以减小测序错误的影响（相对于高丰度序列，低丰度序列出现测序错误的概率更高，cluster中选取高丰度序列作为代表，避免了低丰度序列直接参与后续分析）。

ASV：DADA2软件将输出结果称为ASV，类似于按%相似度聚类得到的OTU序列。

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3物种组成分析

物种组成分析：对样本从门、纲、目、科、属、种多个分类学层级进行物种鉴定和注释。

展示形式：柱形图、热图、Circos图等。

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4α多样性分析

α多样性：指特定生境或者生态系统内的多样性情况，通常利用物种丰富度（种类情况）与物种均匀度（分布情况）两个重要参数来计算。主要展示observed_species（即sobs，也称为richness），Chao1，ACE，Shannon，Simpson，Pielou’sevenness（peilou），PD-wholetree和Good’sCoverage等八大类常用的α多样性指数以及它们的相关分析结果。

Sobs、Chao1、ACE指数主要关心样本的物种丰富程度，其中Sobs表示检测到的OTU个数，Chao1和ACE表示预测的OTU个数。Simpson、Shannon综合体现物种的丰富度和均匀度，故指数的高低还会受均匀度影响，样本中的物种分布越均匀，多样性越高。peilou指数指均匀度，仅反映均匀度，数值越大，越均匀。PD-wholetree指数则基于OTU序列进化树的系统发育特征，评估多样性程度，即谱系多样性。Good’sCoverage反映样本的测序饱和度；

展示形式：多样性稀释曲线、rank丰度曲线等。

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5β多样性分析

β多样性：指生态系统间物种多样性的差异，可简化理解为是对样本/分组间菌群结构进行的比较，beta多样性指数与物种有无、物种丰度有关。可采用4种方法对beta多样性指数进行分析，Jaccard距离指数主要基于物种有无评估菌群结构的差异。Bray_curtis和Eucliden（PCA）基于物种有无和物种丰度。unweighted_Unifrac基于物种进化距离。weighted_unifrac基于物种进化距离和物种丰度。

基于距离指数进行PCoA、NMDS直观展示样本间菌群结构的差异程度，采用Adonis和Anosim两种检验模型，判断分组间菌群结构差异的显著性。

展示形式：散点图和盒形图等。

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6指示物种分析

指示物种分析：通过对样本间、分组间的物种进行分析，找出样本间/组间潜在的biomarker，主要包括LEFse分析、随机森林分析和ROC曲线分析等。LEFse分析组间菌群差异，找出各组间（≥2组）特异的主要菌群，有助于开发biomaker等研究。随机森林分析是一种包含多个决策树的集成学习方法，在微生物多样性的研究中随机森林常被用来筛选潜在的指示物种。ROC曲线分析可用于评估物种作为biomarker的正确性，即是否能够把样本按预期分成2个分组的能力，综合考虑了物种区分能力的灵敏度和准确度。

展示形式：箱线图、饼图、气泡图和ROC曲线图等。

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7功能分析

功能分析：是指利用生物信息学和不同表达系统对基因的功能进行的预测、鉴定和验证，主要包括PICRUSt2、Tax4Fun、Bugbase和FAPROTAX，见下表。

展示形式：柱形图、热图等。

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参考文献

[1]LangilleMGI,ZaneveldJ,CaporasoJG,etal.Predictivefunctionalprofilingofmicrobial